最後に，フォトサーマル効果を用いたナノポア温度コントロール技術を用いて，シトクロムcの検出を行った。レーザーを用いてポア自体を加熱すると，シトクロムcの捕捉時間が延長され，遮断電流値の分布が0.54〜0.64から0.64〜0.84へとシフトした（図4（b））。この遮断電流値の変化を理解するために，MDシミュレーションを実施した。図4（c）と図4（d）に印加電圧場において，常温条件と加熱条件でのシトクロムcの立体構造状態を示す。このシミュレーション結果は，温度上昇によりαヘリックスの中心領域（特に残基49〜70）が不安定化することを示唆しており，350 Kではこの領域が選択的にほどけることが確認された。一方で，電場による変性ではN末端・C末端の解離が優先されることから，電場と温度は異なる構造要素に作用し，異なる展開経路を誘導することが分かる。つまり，同じタンパク質であっても，作用する物理的刺激の種類によってまったく異なる中間構造状態が出現する可能性が示された。
総じて，本研究はフォトサーマルナノポアという新たなアプローチを提示することで，タンパク質の中間構造状態の観察に成功した。この技術がさらに洗練されれば，生命分子のリアルタイム解析から創薬から診断に至るまで，広範な分野に革新をもたらすことは可能性を秘めている。本研究成果の詳細については，文献8）と文献2）を参照いただきたい。
参考文献
1）Xue, L.; Yamazaki, H.; Ren, R.; Wanunu, M.; Ivanov, A. P.; Edel, J. B., Solid-state nanopore sensors. Nature Reviews Materials 2020, 5 (12), 931-951.
2）Yamazaki, H.; Mabuchi, T.; Kaito, K.; Matsuda, K.; Kato, H.; Uemura, S., Photothermally Heated Asymmetric Thin Nanopores Suggest the Influence of Temperature on the Intermediate Conformational State of Cytochrome c in an Electric Field. Nano Letters 2024, 24 (33), 10219-10227.
3）Li, J.; Stein, D.; McMullan, C.; Branton, D.; Aziz, M. J.; Golovchenko, J. A., Ion-beam sculpting at nanometre length scales. Nature 2001, 412 (6843), 166-169.
4）Storm, A. J.; Chen, J. H.; Ling, X. S.; Zandbergen, H. W.; Dekker, C., Fabrication of solid-state nanopores with single-nanometre precision. Nature Materials 2003, 2 (8), 537-540.
5）Patterson, N.; Adams, D. P.; Hodges, V. C.; Vasile, M. J.; Michael, J. R.; Kotula, P. G., Controlled fabrication of nanopores using a direct focused ion beam approach with back face particle detection. Nanotechnology 2008, 19 (23), 235304.
6）Karhanek, M.; Kemp, J. T.; Pourmand, N.; Davis, R. W.; Webb, C. D., Single DNA Molecule Detection Using Nanopipettes and Nanoparticles. Nano Letters 2005, 5 (2), 403-407.
7）Kwok, H.; Briggs, K.; Tabard-Cossa, V., Nanopore fabrication by controlled dielectric breakdown. PLoS One 2014, 9 (3), e92880.
8）Yamazaki, H.; Hu, R.; Henley, R. Y.; Halman, J.; Afonin, K. A.; Yu, D.; Zhao, Q.; Wanunu, M., Label-Free Single-Molecule Thermoscopy Using a Laser-Heated Nanopore. Nano Letters 2017, 17 (11), 7067-7074.
■Label-Free Protein Structural Dynamics Analysis at the Single-Molecule Level Using Photothermal Nanopores
■Hirohito Yamazaki
■Nagaoka University of Technology, Department of Mechanical Engineering, Associate Professor
