製造現場での高分解能観察のための構造化照明顕微鏡

3.　低コヒーレンス干渉による構造化照明

構造化照明顕微法を非蛍光観察に応用するにあたってスペックルノイズの影響を調査した。ここでは，レーザ（DPSS，波長532 nm，スペクトル幅0.1 nm）およびSLD（中心波長669 nm，スペクトル幅7 nm）の二光束干渉をそれぞれ構造化照明として用いた場合のシリコンドット（0.2μm径）の光学顕微鏡観察結果を比較する。低コヒーレント光源として用いたSLDのコヒーレント長の理論値は32μmと短く，二光束干渉させるためには綿密な光路長調整を要するため，マイケルソン型の干渉光学系を採用した。

図3に観察試料パターンに依存して発生するスペックルノイズの例を強調表示する。ドット中心に対して同心円状のスペックルノイズが確認できるが，SLDの場合に影響が小さいことが分かった。なお，レーザの場合のノイズ強度は，画像における最大強度の10％を超えており，平均化効果によっても抑制が困難なため，高分解能化のための再構成結果においてアーチファクトを発生させる。

つづいて，構造化照明の下，シリコンドット（0.2μm径）が一様に配置されたパターンを光学顕微鏡（対物レンズNA0.55）で暗視野観察した結果を図4に示す。取得画像およびの試料ステージ走査の結果を解析したところ，0.470μmのピッチを有する構造化照明の生成を確認した。なお，二光束干渉の入射角45°から計算されるピッチは0.473μmであり，計算結果は理論値と良く一致した。

右図に示したカラー画像は顕微鏡視野全体の取得画像である。中央部分に確認できるモアレ縞は構造化照明と観察試料パターンによるものであり，構造化照明の生成領域を示している。次に，視野全体画像における構造化照明のラインプロファイルを図5に示す。光路差ゼロ位置において最大のコントラストを有する低コヒーレンス干渉の挙動が確認できた。ラインプロファイルから確認できる構造化照明生成領域はおよそ30μmであり，用いたSLD光源のコヒーレント長の理論値32μmと良く一致した。

4.　構造化照明の位相検出機構

構造化照明顕微法の製造現場での利用にあたって，想定される振動の下でも高分解能化を実現するために，低コヒーレンス干渉に基づいた位相検出機構を導入した。図6に光学系の上面図，図7に暗視野顕微鏡の側面図を示す。赤外SLD光源が一般的であるが，検証の容易さの観点から，可視SLD（中心波長669 nm，スペクトル幅7 nm）を使用した。シングルモードファイバとコリメートレンズを通過した光は，ハーフミラーによって振幅分割され，マイケルソン干渉計（図6下部）により二光束干渉させることで観察試料上に構造化照明を生成する。一方のアームには低コヒーレンス干渉のための光路長調整機構，他方のアームには，ビームパワーを揃えて干渉コントラストを向上させるために別途ハーフミラーを配置した。

中央部の顕微鏡光学系では，試料からの散乱光を暗視野観察する。（図7）観察試料を正反射した光は，もう一つのマイケルソン干渉計（図6上部）によって低コヒーレンス干渉し，検出器で干渉縞として観測される。この干渉信号から構造化照明の位相を検出する。なお，位相検出機構の導入により，構造化照明の高精度位置決め制御が不要となったため，従来使用していたピエゾステージを安価なステッピングモータステージに置換することができた。