順天堂大,2色光線−電子相関法を開発

順天堂大学は,光線-電子相関顕微鏡法(In-resin CLEM)に応用可能な2つの緑色蛍光タンパク質と1つの赤色蛍光タンパク質を新たに見出し,エポキシ樹脂を用いた高精度の2色光線−電子相関法(Two color In-resin CLEM)の開発に世界で初めて成功した(ニュースリリース)。

CLEMは,蛍光像と電子顕微鏡像を相関させる手法で,蛍光タンパク質による細胞や細胞小器官の標識により,組織・細胞内での局在(位置や量)を明らかにしながら,超微細構造を電子顕微鏡によって解析する。

研究グループは,これまで遠赤色蛍光タンパク質を用いて,電子顕微鏡の生物試料作製にエポキシ樹脂包埋試料を用いて高精度の光線−電子相関法(In-resin CLEM)を成功させてきた。しかし,蛍光タンパク質を用いて,細胞内共局在や細胞内オルガネラ相互作用などを解析するには少なくとも2色の蛍光タンパク質を用いたIn-resin CLEMが必要だった。

電子顕微鏡の生体試料作製では,超微形態を保持するたの処理により,ほとんどの蛍光タンパク質は蛍光を発する能力を失ってしまう。今回,研究グループは,細胞の処理条件を改良することで,2つの緑色蛍光タンパク質(CoGFPv0とmWasabi),1つの遠赤色蛍光タンパク質(mCherry2)が蛍光能を保持できることを見出した。

これらの蛍光タンパク質を発現している細胞を,電子顕微鏡用試料作製に汎用的に用いられているエポキシ樹脂包埋処理を行ない,100nm厚の超薄切片(ヒト細胞の60〜250分の1の厚さ)を作製し,蛍光顕微鏡で観察した。

その結果,CoGFPv0あるいはmWasabiを発現している細胞内に緑色蛍光が,mCherry2を発現している細胞に遠赤色蛍光が観察された。また,この超薄切片はそのまま電子顕微鏡観察が可能だった。

さらに,核局在CoGFPと小胞体局在mCherry2,核局在CoGFPとミトコンドリア局在mCherry2,小胞体局在mWasabiとミトコンドリア局在mCherry2,のいずれの組み合わせでも,エポキシ樹脂包埋試料の100nm超薄切片にて,2色の蛍光による標的細胞小器官への局在を同時に観察することに成功し,2色の蛍光タンパク質を用いたエポキシ樹脂包埋試料のTwo color In-resin CLEMに世界で初めて成功した。

これにより,複数の種類の細胞からなる特定の組織内のがん細胞と正常細胞の色分けができるようになり,より初期のがん浸潤過程を電子顕微鏡レベルで観察できる可能性があるとしている。

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